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            原谷生物

            免疫分析中異質性抗體干擾相關問題的探討

            來源: 時間:2017-12-20

             免疫分析在過去的30年中有了巨大的進步和提高,但由于動物抗血清是這些試驗的基本成分,所以存在免疫球蛋白(包括異質性抗體、分析物自身抗體等)的干擾,造成假性的和可能導致誤診的結果,繼而給患者造成不適當的進一步測試、不正確的診斷和治療以及潛在的不利結果。因此,重視這些干擾的類型、分析原因、尋找對策,同時與臨床醫生合作用集體的智慧、能力和經驗進行分析總結,排除干擾,合理地對試驗結果進行解釋,從而提高診斷水平是每個檢驗工作者義不容辭的職責。

            1異質性抗體

            1.1定義

            異質性抗體是在人血清中存在的,能識別商品化試劑中應用的動物免疫球蛋白的抗體(如鼠或兔免疫球蛋白)。當免疫原物質,如蛋白或免疫球蛋白,從一個種屬引入另一個種屬時即 可產生異質性抗體。

            1.2 人抗動物抗體

            一般來說,人因診斷或治療的目的用過其他動物制劑,就可能產生抗這種動物的抗體,即人抗動物抗體(human anti-animal antibody,HAAA)。主要包括人抗動物免疫球蛋白、人抗動物白蛋白和人抗昆蟲糖蛋白等。如果患者使用過來自小鼠的藥物或顯像劑,就可以產生人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA),它是影響最大的。按這種形式產生的抗體,一般是特異性抗體并且具有高滴度。

            1.2.1 HAAA產生原因

            醫源性途徑:預防接種,實施非常規治療,如注射抗網織紅細胞增多劑會產生抗兔抗體。

            非醫源性途徑:包括母嬰傳遞、動物耕作和飼養寵物以及在患有腹腔疾病等情況下通過腸壁的食物抗原傳遞。

            1.2.2抗體類型和特異性

            人抗動物抗體有IgG、IgA、IgM IgE幾種類型。人抗動物免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)的抗體可有抗獨特型和抗同種型特異性,還可產生抗抗獨特型抗體。通常同種型抗體比獨特型抗體更常見。目前己報道了多種動物免疫球蛋白特異的人循環抗體,包括抗小鼠、抗兔、抗山羊、抗綿羊、抗牛、抗豬、抗大鼠、抗馬、抗嵌合抗體以及混合特異性抗體。其中最常見的是HAMA??雇煤蜕窖?span lang="EN-US">Ig的抗體也特別重要。這幾種動物常作為免疫分析試劑中抗體的來源。由于不同種動物Ig分子間蛋白質序列有大量同源性。因此抗動物抗體可與多種動物Ig發生交叉反應。如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、 牛、豚鼠、兔、貓和狗等。

            1.2.3 HAAA對免疫分析的干擾機制及進展

            異質性抗體可以與免疫分析應用的動物抗體結合,并由此產生錯誤的結果。在雙位點夾心免疫分析中,該抗體在無抗原的條件下,可以聯接捕捉抗體和檢測抗體,導致假陽性結果;在另一種情況下異質性抗體可能阻斷捕獲抗體或標記抗體降低其結合抗原的能力,從而使抗原和信號抗體不能固定在固相上,在洗滌過程中去除,使結合信號出現假陰性。另外,在固相競爭性免疫分析中,HAMA通過阻斷捕獲抗體的結合位點造成干擾。這可能為HAMA與捕獲抗體或標記抗體的抗原結合區反應而阻止其與分析物反應之故。待測抗原和標記抗原與捕獲抗體的高親和力可把干擾降到最小。但若HAMA濃度高或樣品用量大仍可出現干擾;用雙抗體技術把結合與游離標記物分離,仍存在干擾問題。

            還有一些因素在干擾中起非常重要的作用:(1)由于試劑抗體濃度總是固定的,而干擾抗體的滴度對每個患者都是不同的, 因此干擾抗體與試劑抗體相比,具有較寬范圍的親和力,如果進行樣本稀釋將會進一步改變試劑抗體和干擾抗體的比例,繼而導致更加嚴重的后果;(2)捕捉抗體是單克隆的,信號抗體有單克隆的也有多克隆的,而干擾抗體通常為多克隆的??乖瓕慰寺】贵w結合的親和力較單一,當免疫反應涉及多克隆抗體時會更加復雜多變;(3)自動化儀器的誕生,使實驗周轉時間(time around time, TAT)大幅縮短,當干擾抗體滴度較高時,這種全自動、短溫育時間的非平衡試驗會增加對干擾的敏感度,干擾強度 大于干擾的親和力;(4)免疫試驗的干擾強度取決于試驗形式、 相關干擾抗體的親和力及其滴度。有些干擾抗體,或是抗原或是試劑抗體,作為互相反應的實體未能確認,當成為抗原-抗體結合復合物后會改變免疫分析的動力學;(5)抗原可以有一個以上的表位,抗體也可有一個以上的對位,在平衡免疫分析中通常按優先結合原則,但正常的結合反應可以在抗原或抗體上有一個以上的結合位點,干擾抗體的存在會打破這種結合反應,造成不同的干擾結果。所有這些因素都提示抗體干擾保持著它是隱蔽的、可變的和不可預見的問題。

            1.2.4 HAAA檢測方法

            HAAA測定對鑒定免疫分析技術中可能出現的假性高值或低值及在治療上評估反復使用動物源性制劑可能的并發癥具有重要意義。HAMA的檢測方法包括免疫復合物直接測定法(高壓液相色譜法)、免疫熒光測定、免疫熒光抑制試驗、免疫放射法、酶聯免疫吸附試驗法、反向ELISA法 和斑點雜交法。這些方法非一般臨床實驗室所能應用。HAMA 測定的校準物包括狒狒抗鼠IgG、血清或來源于注射單克隆抗體的患者血漿。目前國外已有多種HAMA檢測試劑盒,甚至床邊檢驗試劑,但是由于分析技術特異性差異和缺乏標準化,使各方法間和實驗室間缺乏可比性。

            1.2.5 HAAA克服方法

            (1) 封閉劑法:是目前比較常用的方法,此法通過加入未經免疫的同種動物血清或純化的同源非特異性免疫球蛋白對樣品作預處理來減少或消除HAAA干擾。一般采用產生單克隆抗體動物的血清或多克隆IgG或聚合IgG。阻斷劑的阻斷效力取決于HAAA的濃度、種類、分子亞型、特異性和效價。這些阻斷劑通過與樣品中人抗動物抗體結合而抑制其干擾免疫分析。 目前國外己有Ig阻斷劑(IIR)和嗜異性阻斷劑(HBR)等多種阻斷劑商業供應。

            (2) 改變試驗系統:應用不同類型的單克隆抗體的試驗系統,或者采用競爭法重新進行測定,均能解決干擾問題,但此法不完全可靠。

            (3) 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法或親和層析法:PEG法采用PEG6000HAAA進行沉淀以達到清除 HAAA的目的。此外,蛋白A、陽離子交換或凝膠過濾層析法也 可以作為排除HAAA干擾的輔助手段。雖然非免疫血清或純免疫球蛋白的加入及各種阻斷劑的使用排除了大多數的 HAAA干擾,具有高滴度HAAA的血清仍然存在非特異性干擾。在有些情況下,HAAA雖然被清除,但阻斷劑的使用卻引 起質控樣品的濃度漂移。

            (4) 酸和熱聯合處理:在某些情況下對樣品進行熱和酸處理 可以達到阻斷HAAA于擾的目的。例如在癌胚抗原(carcino- embryonic antigen, CEA)免疫分析中,將樣品在酸性環境下加熱 至70°C90°C能使HAAA干擾得到遏制。但此法在多數情況下不可取,因為在這種熱和酸條件下大多數被分析物都會被破壞。

            (5) 蛋白G:蛋白G能與所有4IgG亞類分子的Fc片 段結合。因此,可以將蛋白G固相于sepharose珠對待測血清進行免疫抽提來清除其中的所有IgGHAMA。

            (6) 應用改造的抗體:用人工組合的抗體,即將動物Fab與 人Fc組合,可消除對IgG類抗體試劑的Fc段有特異性反應性的抗動物抗體干擾;應用嵌合抗體作分析試劑可消除抗小鼠和其它動物抗體引起的干擾。另一辦法是用雞抗體作分析試劑,因為哺乳動物和雞IgG無交叉反應性,故可消除人抗哺乳動物抗體對免疫分析的干擾。但此法制備困難而且價格昂貴,不適于臨床實驗室使用。

            2 免疫分析中抗體干擾的預防

            由于免疫分析的復雜多變,所以對其干擾的預防應從以下幾方面努力:

            1)從標本中清除或滅活干擾性免疫球蛋白,可通過將患者標本預先用PEG或濾過的方法共沉或分離聚合物,但應根據測試項目進行適當選擇;

            2)改造抗體,以減少與異質性抗體的反應。動物抗體的人源化和抗體改造(采用去除Fc片段的方法);

            3)封閉劑的使用,采用產生單克隆動物的血清或多克隆IgG或聚合IgG,目前一些商品化試劑己包含封閉劑可有效去除干擾;

            4)應用緩沖液添加劑可預防或降低干擾,天然的動物免疫球蛋白常有效。

            另外,在常規實驗室建立一個處理潛在干擾的質量系統也是很重要的。當然這會涉及員工的培訓(包括實驗室操作人員、 樣本采集人員),發展和改良標準操作步驟,建立檢測預警值,與臨床醫生的溝通機制,干擾發現后與廠商的溝通機制等。

            3 抗體干擾的醫學意義及人文思考

            3.1醫學意義

            當患者的醫療決策與試驗結果相關聯,而沒有在臨床上確證的好方法時,試驗干擾可造成明顯的醫學問題。盡管實驗室專業人員沒有可靠的方法檢測干擾抗體的存在,但其臨床意義是非常大的。由于分析方法特異性的不同和缺乏標準化使得不同方法間的比較也變得相對復雜。用腫瘤標志物檢測腫瘤和對內分泌疾病的激素標志物是這個關鍵試驗檢測的最佳例證。如用于診斷絨毛膜上皮癌的人絨毛膜促性腺激素(hCG); 檢測前列腺癌的前列腺特異抗原 (PSA); TSH對于甲狀腺功能亢進及低下的診療;檢測卵巢癌的糖鏈抗原CA-125; CEA;泌乳素;cTnl 等等都是著名的例子,下面舉幾個典型實例以引起大家的關注。

            ColeKhanlian報告hCG是一項重要的試驗,用于證實妊娠、確定妊娠性滋養葉細胞疾病和男性的睪丸胚胎性腫瘤。由于是一個強有力的腫瘤標志物,在非妊娠婦女和男性出現,即使沒有癥狀也標志著惡性的疾病過程。作者報告了因其假陽性結果,使患者接受侵襲性方法的治療,包括:刮宮、腹腔鏡、化療、子宮切除、輸卵管卵巢切除和開胸術。給患者帶來了極大的痛苦和經濟損失,同時也使醫患關系變得復雜。Birkland報道了美國西雅圖一位22歲女性因異質性抗體干擾使hCG假陽性而經歷化療、子宮切除、肺部分切除,最終法院判給她1600萬美元。 RotmenschCole報告了12例誤診為絨毛膜上皮癌而進行治療的病例,均是由于在免疫分析中的異質性抗體搭橋干擾hCG檢測所致,男性患者有假陽性hCG可被誤診為睪丸精原細胞瘤。

            PSA是前列腺癌篩查和腫瘤復發的關鍵標志物,臨床醫生常根據PSA的測定值決定做進一步的侵襲性檢查,如前列腺活檢或昂貴的影像學檢查。最近的報告表明,可能的過度治療是由于假性PSA測定結果所致,而這些假性結果是由于異質性抗體搭橋的結果。一位49歲男性患者,由于其PSA未達到手術后的預期值而使用激素治療和放射治療。

            CA-125是一種腫瘤標志物,用以監測卵巢癌的復發和對高危人群是否患卵巢癌的評估。用于CA-125試驗的單克隆抗體也用于卵巢癌的治療,注射這種抗體常使異質性抗體增加,并造成假陽性的實驗結果,即使沒有這種免疫治療,有些患者手術后可產生內源性異質性抗體,并造成卵巢癌復發的假象, 用CA-125評估可能患卵巢癌的高危人群,往往導致多余的腹腔鏡和腹腔細胞學的檢查。

            這些實例不但給我們深刻的教訓,同時還給實驗室和臨床敲響了警鐘,可見二者之間的交流和合作何等重要。

            3.2人文思考

            在醫療中,一定的誤診率是難免的,在我國臨床醫療總誤診率為27.8%,比國際平均的臨床醫療總誤診率25%2.8個百分點,其中惡性腫瘤誤診率為40%??贵w干擾造成的誤診也是原因之一,和其它原因導致的誤診一樣,所有抗體干擾造成臨床誤診的病例,最終都不同程度的造成患者遭受過度醫療(如各種相關的實驗室檢查、影像學檢查、侵襲性檢查及不必要的治療)的危害。使患者物質和精神上都受到了折磨,給社會和家庭帶來了沉重的負擔,也使醫患關系更加惡化。

            盡管在本文中討論了免疫分析中可能存在的干擾,但免疫分析仍是一個強有力的檢測系統。沒有能事先確定標本有免疫干擾的實用的方法。因此,實驗室工作人員必須加強學習,不斷吸收新的知識和獲得新的技能,不斷提高業務水平,提高綜合素 質,同時依賴與臨床醫生的交流去確定可能由于試驗干擾造成的可疑的試驗結果。當實驗室示警后,應進行各種相關檢測排除干擾,稀釋線性試驗、加入回收率、異質性抗體封閉和用另一種技術再測定等簡單的步驟,有助于對懷疑有試驗干擾的病例進行評價。我們不相信現在計數測量可以完全消除抗體的干擾,我們等待著最終根治方法的來臨。只有臨床化學家、實驗室檢測人員、生產廠家和臨床醫生共同努力才能解決干擾問題、 提高診斷水平,從而更好地為患者服務。

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