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            原谷生物

            內源性干擾對免疫分析的影響

            來源: 時間:2018-01-03

            免疫分析受多種因素影響,包括內源性干擾。內源性干擾可引起假性結果,導致誤診或不必要的檢查、治療。大部分學者是在試驗結果可疑或與臨床不符時,回顧性地尋找干擾原因,通過不同方法驗證內源性干擾存在,然后設法消除干擾,再重新測定。目前,對內源性干擾的機制、消除方法等問題已有所了解但還不是很成熟,有待進一步研究。

            下面對內源性干擾的類型、干擾機制以及消除方法進行總結。

            自身抗體

            1.產生原因 自身抗體是針對自身抗原成分產生的一類抗體,可能與惡性疾病或自身免疫紊亂有關。常見的影響免疫分析的自身抗體有抗甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)、抗甲狀腺激素抗體、抗甲狀腺激素受體抗體、抗胰島素抗體等。

            2.產生的干擾及干擾機制 自身抗體的出現改變了相應抗原的濃度,可產生假性結果,影響程度和游離抗原與抗原-抗體復合物的比例、抗體性質、反應類型及試劑成分有關。

            3.解決方法  1)測定前用解離液將抗原-抗體復合物解離。2)當懷疑結果受自身抗體干擾時,換一種方法進行檢測。3)聚乙二醇(PEG)處理去除抗體。4)凝膠過濾或PEG預處理可消除巨泌乳素干擾。5)瓊脂糖G蛋白沉淀法可降低干擾。6)用其他檢查或其他檢驗結果驗證結果的準確性。

            異嗜性抗體(HAb

            1. 產生原因  HAb的產生可能與使用動物蛋白或動物IgG進行治療、接種疫苗、接觸動物、進食受污染的食品或未經高溫消毒的鮮奶有關。單克隆抗體治療的發展使HAb干擾問題日益普遍。

            2. 產生的干擾及干擾機制 文獻報道,人絨毛膜促性腺激素(hCG)、前列腺特異性抗原(PSA)、促黃體生成激素(LH)、甲狀旁腺激素(PTH)、降鈣素、CA125等檢測受到HAb的干擾。HAb還可干擾嗜鉻粒蛋白A、類胰蛋白酶的測定,也可引起肌紅蛋白、TSH假性增高。另有HAb干擾導致Tg未被檢出的報道。

            3. 消除方法  1)封閉HAb。異嗜性抗體封閉劑(HBR)、免疫球蛋白抑制劑(IIR)、異嗜性抗體封閉管(HBT)可消除HAb干擾。2)聚乙二醇預處理沉淀抗體。3)對熱穩定的組分加熱處理。4)利用基因工程重組單鏈抗體片段做捕獲抗體。5)以非IgG親和蛋白作固相抗體或酶標抗體。6)用雞抗體作為固相抗體和檢測抗體。7)去除分析抗體Fc片段,改變分析抗體的結構或進行化學修飾。8)使用不受HAb影響的方法進行分析。9)用其他類型標本進行測定加以驗證,如HAb引起血hCG假性增高,可預定尿液hCG。10)利用不同IgG亞類作抗體可降低HAb干擾。11)重組單克隆IgY作試劑抗體能防止干擾現象。

            人抗動物抗體(HAAA

            1. 產生原因  使用鼠抗體進行診斷或治療、接觸鼠類、疫苗接種、輸血、母嬰傳播可導致人抗鼠抗體(HAMA)的產生。

            2. 產生的干擾及干擾機制 HAMA主要干擾心臟標志物、甲狀腺功能測試、毒品、腫瘤標志物(如CEA、PSA)、PTH、人絨毛膜促性腺激素、風疹病毒IgM、性激素等,引起假性結果。

            HAMA通過不同機制產生不同的干擾。在雙位夾心免疫測定法中,HAMA可橋聯捕獲抗體及檢測抗體引起假陽性干擾。HAMA作用于檢測抗體,也可導致檢測結果偏高。HAMA可分別與捕獲抗體和檢測抗體結合,使其不能與待測物結合而引起假陰性。HAMA也可只結合捕獲抗體甚至覆蓋整個表面,引起部分或完全封閉作用,抗原無法結合捕獲抗體,引起假陰性干擾。在競爭法測定中,高濃度HAMA也可產生干擾。

            3.消除方法   1)預防HAMA的產生,接受鼠源性抗體診斷或治療前、中、后期,使用免疫抑制劑可有效防止HAMA的產生;或用Fab’2片段、化學修飾可降低其免疫原性。2)使用IIR等封閉劑預處理。3)用Fab’2片段代替完整的IgG或用單克隆嵌和抗體作捕獲抗體或檢測抗體。4)使用雞抗體作捕獲抗體或檢測抗體。5)聚乙二醇預處理。6)對熱穩定分析物加熱處理消除血清中的HAMA。7)加入鼠IgG預孵育可中和標本中的HAMA。8)改變試劑中動物抗體種類,如以羊抗體代替鼠抗體。

            類風濕因子(RF

            1. 產生原因   RF是一類以自身變性IgG為靶抗原的抗體,是一種經典的人抗人免疫球蛋白。RF主要存在于類風濕關節炎患者血漿中,也可存在于其他疾病患者及3%-5%健康者中。

            2. 產生的干擾及干擾機制   RF作用與異嗜性抗體相似。RFELISA法檢測D-二聚體,乙型肝炎標志物等干擾明顯,也可干擾TSH、cTnl、甲狀腺激素、性激素結合球蛋白(SHBG)、脂肪酶、TORCH IgM抗體、CA19-9等項目的測定。

            RF可與IgG Fc片段結合,因此RF能橋聯捕獲抗體和檢測抗體從而引起干擾。在ELISA測定試驗中,RF可吸附至固相抗體上,然后直接與酶結合物反應而顯色,從而導致假陽性。RF干擾在捕獲法測定IgM抗體尤為突出,與IgG發生聚集作用也是RF干擾機理之一。

            3. 消除方法  1IgM抗體滴度較高,稀釋法可避免RF干擾IgM抗體測定。2)將經熱變性的動物IgG與聚苯乙烯微球結合后加入血清中,反應后離心清除標本中RF。3)用雞抗體作固相抗體和酶結合物。4)酶結合物中IgG Fab’2替代IgG Fc。5)用還原劑使RF降解,2-巰基乙醇可使RF的巰基裂解。6PEG沉淀法,人γ-球蛋白預吸收法可消除RF干擾。7)用羊抗人IgG抗體、G蛋白、致敏乳膠等方法也可消除RF干擾。8)用抗人IgM抗體中和RF。9)重組單克隆IgY作試劑抗體能防止干擾現象。

             血清指數(溶血、黃疸、酯血)

            1. 產生原因  機體疾病是體內溶血、黃疸、脂血產生的主要原因。自身免疫性疾病引起自身免疫性溶血;肝膽疾病、自身免疫性溶血引起膽紅素升高;脂肪代謝紊亂、高脂飲食。輸注脂肪乳等可引起高脂血癥。

            2. 產生的干擾及機制 溶血對分析的影響取決于分析方法,其干擾程度與檢測方法、抗體特異性、溶血程度有關。溶血時紅細胞破壞釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白,在以辣根過氧化物酶為標記物的ELISA法分析中,導致非特異性顯色,出現假陽性結果。

            3.解決方法 1)將血紅蛋白或膽紅素相應抗體結合到聚苯乙烯微球與血清反應,離心將血紅蛋白或膽紅素清除。2)膽紅素氧化酶可降低或消除膽紅素的干擾。3)空腹采血、超濾、高速離心、乙醚提取法、環糊精脫脂法等可降低脂血影響。4)可用PEG沉淀含載脂蛋白B的脂蛋白。5)使用脂質澄清劑與標本按一定比例進行混合。

             其他蛋白

            補體、溶菌酶、副蛋白和結合蛋白等也對免疫分析產生干擾。

            1.補體 ELISA法中固相抗體和酶結合物均可激活血清補體系統。補體可與IgG Fc片段結合,將捕獲抗體和檢測抗體連接起來,從而出現假陽性結果?;罨a體可與固相抗體結合,封閉抗體的特異性結合位點,阻斷抗原與抗體的特異性結合,導致假陰性。補體可對免疫放射測定法測定TSH,hCG產生負干擾。消除方法:156℃加熱30min;2)紫外線照射,機械振蕩;3)用雞抗體作捕獲抗體和檢測抗體;4)用稀釋液稀釋標本;5)加入EDTA避免補體激活;6)溫室存放數天再檢測。

            2.溶菌酶 溶菌酶是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶,廣泛存在于機體體液中。溶菌酶能結合等電點較低的IgG,橋聯固相抗體和酶結合物導致假陽性。卵清蛋白和銅離子等能封閉溶菌酶,防止其與IgG結合。

            3.副蛋白 副蛋白是單克隆B淋巴細胞或漿細胞大量增殖產生的具有相同氨基酸序列和蛋白質結構的Ig分子或片段。副蛋白可結合檢測抗體從而引起免疫分析干擾。樣本與動物血清孵育離心沉淀M蛋白可消除干擾。

            4.結合蛋白 激素結合球蛋白等可通過結合分析物或與分析物解離而改變分析物濃度。改變pH值、使用化學試劑可使復合物解離。

            5.高濃度Ig  間接法測定IgM抗體時,血清中特異性IgG抗體可與分子較大的IgM競爭結合有限的固相抗原,造成假陰性。若存在抗IgGIgMRF,RF可結合IgG,RF可被抗IgM酶標記物識別造成假陽性;清除IgG 的方法:蛋白IgGFc段有高親和力,可請除大部分IgG;離子交換層析技術;羊抗人IgG稀釋液;重組瓊脂糖G蛋白。

             交叉反應

            如果存在與分析物結構相似的內源性物質,或分析物的代謝產物與分析物有共同的交叉反應表位均可導致免疫分析中出現交叉反應、交叉反應物與試劑抗體發生反應,相當于增加了標本中分析物的含量,可導致假陽性。交叉反應也可以導致假性低值,因為在洗滌或分離步驟中交叉反應物比分析物解離得更快。

             高劑量鉤狀效應

            抗原抗體比例合適時兩者形成的免疫復合物的量最多,當抗原過量時形成的免疫復合物的量由上升轉為下降。高劑量鉤狀效應對ELISA、免疫比濁法的影響較大,可使高濃度標本結果降低,甚至出現假陰性結果。一步法ELISA血清與酶結合物同時加入,游離抗原與抗原-酶結合物復合物競爭結合固相抗體,部分酶結合物只與抗原形成復合物而沒有形成固相抗體-抗原-酶結合物復合物從而被洗掉,導致結果假性降低。兩步法ELISA分析中固相抗體與抗原反應后再加入酶結合物,一般不容易出現高劑量鉤狀效應,但仍可能因飽和現象低估抗原含量。消除方法:1)用稀釋液對高濃度標本進行稀釋;2)適當增加固相抗體和酶結合物的含量;3)設定儀器參數,自動識別高劑量鉤狀效應;4)反應在振動條件下進行可抑制高劑量鉤狀效應。

            小結

            當試驗結果與臨床癥狀不一致時,或患者曾接受動物制劑診斷或治療,或有類似試驗干擾史時應積極評價內源性干擾。試驗人員應加強與臨床醫生溝通,獲取患者相關信息。加強繼續教育,使試驗人員充分了解內源性干擾。臨床醫生也應充分認識內源性干擾對試驗的影響,正確評價試驗結果,避免被試驗結果誤導。 

             

             

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